Oxidative and osmotolerant effects in Salvator merianae (Squamata: Teiidae) red blood cells during hibernation / Efeitos de oxidação e osmotolerância dos eritrócitos de Salvator merianae (Squamata: Teiidae) durante a hibernação

Abstract Hibernation is a natural condition of animals that lives in the temperate zone, although some tropical lizards also experience hibernation annually, such as the lizard native from South America, Salvator merianae, or "tegu" lizard. Even though physiological and metabolic characteristic associated with hibernation have been extensively studied, possible alterations in the red blood cells (RBC) integrity during this period remains unclear. Dehydration and fasting are natural consequences of hibernating for several months and it could be related to some cellular modifications. In this study, we investigated if the osmotic tolerance of RBCs of tegu lizard under hibernation is different from the cells obtained from animals while normal activity. Additionally, we indirectly investigated if the RBCs membrane of hibernating tegus could be associated with oxidation by quantifying oxidized biomolecules and the activity of antioxidant enzymes. Our findings suggest that RBCs are more fragile during the hibernation period, although we did not find evidence of an oxidative stress scenario associated with the accentuated fragility. Even though we did not exclude the possibility of oxidative damage during hibernation, we suggested that an increased RBCs volume as a consequence of hypoosmotic blood during hibernation could also affect RBCs integrity as noted.

Resumo A hibernação é uma condição natural dos animais que vivem na zona temperada, embora alguns lagartos tropicais também experenciem hibernação anualmente, como é o caso do lagarto nativo da América do Sul, Salvator merianae ou "teiú". Embora as características fisiológicas e metabólicas associadas à hibernação tenham sido amplamente estudadas, possíveis alterações na integridade das hemácias durante esse período ainda permanecem obscuras. A desidratação e o jejum são consequências naturais da hibernação por vários meses e podem estar relacionadas a algumas modificações celulares. Neste estudo, investigamos se a tolerância osmótica de hemácias do lagarto teiú sob hibernação são diferentes das células obtidas de animais em atividade normal. Além disso, investigamos indiretamente por meio da quantificação de biomoléculas oxidadas e da atividade de enzimas antioxidantes se a membrana das hemácias dos teiús em hibernação poderia estar associada à oxidação. Nossos resultados sugerem que as hemácias possuem maior fragilidade durante o período de hibernação, embora não tenhamos encontrado evidências de um cenário de estresse oxidativo associado à essa fragilidade acentuada. Embora não tenhamos excluído a possibilidade de dano oxidativo durante a hibernação, sugerimos que um aumento no volume das hemácias como consequência de sangue hipoosmótico durante a hibernação também poderia afetar a integridade de hemácias, tal como foi observado.

Oxidative and osmotolerant effects in Salvator merianae (Squamata: Teiidae) red blood cells during hibernation

Abstract Hibernation is a natural condition of animals that lives in the temperate zone, although some tropical lizards also experience hibernation annually, such as the lizard native from South America, Salvator merianae, or tegu lizard. Even though physiological and metabolic characteristic associated with hibernation have been extensively studied, possible alterations in the red blood cells (RBC) integrity during this period remains unclear. Dehydration and fasting are natural consequences of hibernating for several months and it could be related to some cellular modifications. In this study, we investigated if the osmotic tolerance of RBCs of tegu lizard under hibernation is different from the cells obtained from animals while normal activity. Additionally, we indirectly investigated if the RBCs membrane of hibernating tegus could be associated with oxidation by quantifying oxidized biomolecules and the activity of antioxidant enzymes. Our findings suggest that RBCs are more fragile during the hibernation period, although we did not find evidence of an oxidative stress scenario associated with the accentuated fragility. Even though we did not exclude the possibility of oxidative damage during hibernation, we suggested that an increased RBCs volume as a consequence of hypoosmotic blood during hibernation could also affect RBCs integrity as noted.

Resumo A hibernação é uma condição natural dos animais que vivem na zona temperada, embora alguns lagartos tropicais também experenciem hibernação anualmente, como é o caso do lagarto nativo da América do Sul, Salvator merianae ou teiú. Embora as características fisiológicas e metabólicas associadas à hibernação tenham sido amplamente estudadas, possíveis alterações na integridade das hemácias durante esse período ainda permanecem obscuras. A desidratação e o jejum são consequências naturais da hibernação por vários meses e podem estar relacionadas a algumas modificações celulares. Neste estudo, investigamos se a tolerância osmótica de hemácias do lagarto teiú sob hibernação são diferentes das células obtidas de animais em atividade normal. Além disso, investigamos indiretamente por meio da quantificação de biomoléculas oxidadas e da atividade de enzimas antioxidantes se a membrana das hemácias dos teiús em hibernação poderia estar associada à oxidação. Nossos resultados sugerem que as hemácias possuem maior fragilidade durante o período de hibernação, embora não tenhamos encontrado evidências de um cenário de estresse oxidativo associado à essa fragilidade acentuada. Embora não tenhamos excluído a possibilidade de dano oxidativo durante a hibernação, sugerimos que um aumento no volume das hemácias como consequência de sangue hipoosmótico durante a hibernação também poderia afetar a integridade de hemácias, tal como foi observado.

Análise qualitativa do teste de fragilidade osmótica para amostras processadas a fresco ou após 24 horas de incubação a 37ºC / Qualitative analysis of the osmotic fragility test for samples processed fresh or after 24 hours of incubation at 37ºC

Objetivo: Analisar qualitativamente o teste de fragilidade osmótica (F.O.) para amostras a fresco ou após incubação a 37°C. Métodos: Foram processadas 20 amostras de sangue periférico, coletadas em duplicata com 5mL em cada tubo com heparina, de pacientes com solicitação de F.O. como exame de rotina para processamento a fresco e após incubação por 24 horas em banho-maria a 37°C, em 13 tubos com concentrações variáveis de 0,1% a 0,9% de NaCl. Resultados: Foram analisadas 20 amostras de pacientes em sua maioria do gênero feminino 17/20 (85%), com idades entre 3 meses a 75 anos, para realização do teste de F.O. A análise qualitativa dos resultados mostrou que 9/20 (45%) amostras tiveram resultado concordante entre os testes de F.O. para amostras a fresco e após incubação a 37°C. Dos resultados discordantes, 8/11 (72,7%) resultados mostram fragilidade dos eritrócitos à hemólise nas amostras a fresco e curva normal (sem hemólise) após incubação da amostra a 37°C. Outros 3/11 (22,3%) resultados apresentaram curva normal (sem hemólise) no teste com amostra à fresco e resistência à hemólise no teste com a amostra após incubação a 37°C. Com o teste de Extato de Fisher não mostrou diferença estatística (p=0,5743) para as amostras processadas a fresco ou após incubação a 37°C. Conclusão: O teste de F.O. se mostrou mais eficiente quando a amostra testada foi analisada após incubação por 24 horas a 37°C em banho-maria, contudo não houve diferença estatística para resultados processados a fresco ou após incubação a 37°C.

Objective: Qualitatively analyze the osmotic fragility test (O.F.) for samples fresh or after incubation at 37°C. Methods: Twenty peripheral blood samples were processed, collected in duplicate with 5 ml in each tube with heparin, from patients with O.F. request. as a routine examination for fresh processing and after incubation for 24 hours in a water bath at 37°C, in 13 tubes with varying concentrations of 0.1% to 0.9% NaCl. Results: Twenty samples of patients were analyzed, mostly female, 17/20 (85%), aged between 3 months to 75 years, for the O.F. test. The qualitative analysis of the results showed that only 9/20 (45%) samples had a consistent result between the F.O. tests for fresh samples and after incubation at 37°C. From the discordant results, 8/11 (72.7%) results show fragility of erythrocytes to hemolysis in fresh samples and normal curve (without hemolysis) after sample incubation at 37o C. Other 3/11 (22.3%) results showed normal curve (without hemolysis) in the test with fresh sample and resistance to hemolysis in the test with the sample after incubation at 37o C. With the Fisher Extact test showing no statistical difference (p=0.5743) for samples processed fresh or after incubation at 37°C. Conclusion: The O.F. proved to be more efficient when the tested sample was analyzed after incubation for 24h at 37°C in a water bath, however, there was no statistical difference for results processed fresh or after incubation at 37°C.

Esferocitosis hereditaria: experiencia clínica y diagnóstica en Argentina / Hereditary spherocytosis: clinical and diagnostic experience in Argentina / Esferocitose hereditária: experiência clínica e diagnóstica na Argentina

Los objetivos del presente estudio fueron: a) Analizar las características demográficas y clínicas de nuestra población al diagnóstico; b) Evaluar si las pruebas más recientes presentan ventajas sobre las tradicionales; c) Confirmar la frecuencia de las distintas deficiencias de proteínas de membrana; d) Establecer la relación entre severidad y resultado de las pruebas o tipo de deficiencia. Se analizaron 359 individuos estudiados desde 2007, cuando se incorporaron criohemólisis hipertónica (CH), citometría de flujo con eosina-5'- maleimida (5'EMA-CF), FOE por citometría de flujo (FOE-CF) y electroforesis de proteínas de membrana (SDS-PAGE) al estudio de laboratorio clásico, fragilidad osmótica eritrocitaria (FOE) y autohemólisis (AH). Criterios diagnósticos para Esferocitosis Hereditaria (ESH): esferocitos en frotis y dos pruebas positivas. Se identificaron 174 pacientes con ESH y 22 portadores sanos. El 74,9% eran menores de 12 años. La transmisión fue dominante en el 83,1% de los casos. Tuvieron manifestaciones neonatales 89,1%. Las pruebas con mayor sensibilidad fueron CH (92,0%), FOE diferida (91,1%) y 5'EMA-CF (88,5%). En los 125 pacientes en quienes se realizaron CH, 5'EMA-CF y FOE-CF se observó que todos tenían al menos una prueba positiva; 122 (97,6%) tuvieron dos o tres positivas. Las deficiencias más frecuentes fueron ankirina y espectrina. No hubo diferencia en el resultado de las pruebas entre los subgrupos de severidad. Se concluye que las deficiencias más frecuentes en Argentina son ankirina y espectrina, coincidiendo con otras poblaciones latinoamericanas. El uso simultáneo de CH, 5'EMA-CF y FOE-CF permite diagnosticar más del 97% de los casos. La incidencia de manifestaciones neonatales es elevada.

The aims of this study were (a) to assess demographic and clinical aspects of our population at diagnosis; (b) to evaluate diagnostic accuracy of hypertonic cryohemolysis (HC), eosin-5'-maleimide flow cytometry (EMA-FC) and flow cytometric osmotic fragility (OF-FC) in relation to standard screening tests osmotic fragility (OF) and autohemolysis (AH); (c) to confirm the previously reported prevalence of membrane proteins defects; and (d) to assess the relationship between severity of anemia and results of confirmatory tests. Since 2007, the following tests were available in our laboratory: OF, AH, HC, EMA-FC, OF-FC and SDS-PAGE of membrane proteins. Diagnostic criteria for hereditary spherocytosis were spherocytes in blood smear plus ≥2 positive tests. Data from 359 individuals were analyzed: 174 HS patients and 22 silent carriers were detected; 74.9% of patients were less than 12 years old; 83.1% of them showed a dominant inheritance pattern; antecedent of neonatal jaundice/anemia was registered in 89.1%. Tests with higher sensitivity were: HC (92.0%), incubated OF (91.1%), and EMA-FC (88.5%). HC, EMA-FC and OF-FC were simultaneously performed on 125 patients: each of them had at least 1 positive test; 122 (97.6%) had 2 or 3 positive tests. Ankyrin and spectrin were the most frequently found protein deficiencies. Comparison of test results in relation to severity of anemia showed no difference between groups. It can be concluded that compared toother Latin American countries, ankyrin and spectrin were the most frequent protein deficiencies. Simultaneous performing of HC, EMA-FC and OF-FC enabled diagnosing HS in more than 97% of patients. A high incidence of neonatal jaundice/anemia was observed.

Os objetivos do presente estudo foram: a) analisar as características demográficas e clínicas de nossa população ao diagnóstico; b) Avaliar se as provas mais recentes apresentam vantagens sobre as tradicionais; c) Confirmar a frequência das diversas deficiências de proteínas de membrana; d) Establecer a relação entre severidade e resultado das provas ou tipo de deficiência. Foram analisados 359 indivíduos estudados desde 2007, quando se incorporaram crio-hemólise hipertônica (CH), citometria de fluxo com eosina-5'-maleimida (5'EMA-CF), FOE por citometria de fluxo (FOE-CF) e eletroforese de proteínas de membrana (SDS-PAGE) ao estudo de laboratório clássico - fragilidade osmótica eritrocitária (FOE) e auto-hemólise (AH). Critérios diagnósticos para ESH: esferócitos em esfregaço e duas provas positivas. Foram identificados 174 pacientes com ESH e 22 portadores sadios. 74,9% eram menores de 12 anos. A transmissão foi dominante em 83,1%. Tiveram manifestações neonatais 89,1%. As provas com maior sensibilidade foram CH (92,0%), FOE diferida (91,1%) e 5'EMA-CF (88,5%). Nos 125 pacientes aos quais lhes realizaram CH, 5'EMA-CF e FOE-CF se observou que todos tinham no mínimo uma prova positiva; 122 (97,6%) tiveram duas ou três positivas. As deficiências mais frequentes foram anquirina e espectrina. Não houve diferença no resultado das provas entre os subgrupos de severidade. Conclui-se que as deficiências mais frequentes na Argentina são anquirina e espectrina, as quais coincidem com outras populações latinoamericanas. O uso simultâneo de CH, 5'EMA-CF e FOE-CF permite diagnosticar mais de 97% dos casos. A incidência de manifestações neonatais é elevada.

Heparina e K3EDTA como anticoagulantes para tambaqui (Colossoma macropomum Cuvier, 1816) / Heparin and K3EDTA as anticoagulants for tambaqui (Colossoma macropomum Cuvier, 1816)

Este estudo avaliou a eficácia da heparina sódica e do EDTA tripotássico como anticoagulantes e seus efeitos sobre os parâmetros hematológicos de tambaqui (Colossoma macropomum). Foram utilizados dez indivíduos de tambaqui com médias de 384,9 ± 85,71 g de peso e 27,90 ± 2,10 cm de comprimento total para avaliação da heparina 5.000 UI e 100 UI, bem como do K3EDTA 10 por cento. Foram analisados a inibição da coagulação por 10 h, eritrograma e teste de fragilidade osmótica dos eritrócitos. Os resultados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey (P < 0,05). Heparina 5000 UI, heparina 100 UI e K3EDTA 10 por cento foram eficazes na prevenção da coagulação por mais de 10 h, no entanto o EDTA tripotássico causou hemólise desde os primeiros momentos. No eritrograma não foi observada diferença (P > 0,05) na contagem de eritrócitos, hematócrito, taxa de hemoglobina e CHCM, no entanto, houve aumento do VCM (P < 0,05) nas amostras acondicionados com K3EDTA 10 por cento. Este anticoagulante causou incremento (P < 0,01) na fragilidade osmótica dos eritrócitos quando comparado com a heparina pura, heparina diluída, e grupo controle. A utilização da heparina como anticoagulante é mais apropriada para tambaqui (Colossoma macropomum), visto que foi eficiente na prevenção da coagulação por mais de 10 h, sem ocasionar hemólise, ou alterações nos parâmetros hematológicos e na fragilidade osmótica dos eritrócitos.

The efficacy of sodium heparin and tripotassium EDTA as anticoagulant and their effect on the hematological parameters of tambaqui (Colossoma macropomum) were evaluated in this study. Ten fish weighing 384.9 ± 85.71 g and measuring 27.90 ± 2.10 cm were used for heparin 5.000 IU, heparin 100 IU and K3EDTA 10 percent evaluation. Clotting inhibition after 10 h, erythrogram and osmotic fragility of erythrocytes were observed. The results were submitted to variance analysis and means compared by Tukey test (P < 0.05). Heparin 5.000 IU, heparin 100 IU and K3EDTA 10 percent were effective in preventing coagulation for more than 10 h. However, tripotassium EDTA caused hemolysis since first moments. In erythrogram there was no difference (P > 0.05) in erythrocyte count, hematocrit, hemoglobin and MCHC. On the other hand, an increase in MCV (P < 0.05) in samples kept with K3EDTA10 percent was observed. This anticoagulant provoked a significant increase (P < 0.01) in the osmotic fragility of erythrocytes when compared to pure heparin, diluted heparin and the control group. Heparin as an anticoagulant is more appropriate for tambaqui since it was effective in preventing coagulation for more than 10 h, without causing hemolysis, changes on hematological parameters or osmotic fragility of erythrocytes.

Avaliação da influência de variáveis de processo sobre a cinética de desidratação osmótica da polpa de abacate (Persea americana L.) / Evaluation of the influence of process variables on osmotic dehydration kinetics of avocado pulp (Persea americana L.)

O abacate é uma das frutas tropicais cultivadas em diversas regiões do mundo e possui alto valor nutricional, porém é instável a deteriorações. A desidratação osmótica é uma técnica útil na conservação de frutas e vegetais pode ser uma alternativa para estabilização da polpa do abacate. Porém, é necessário estudar o comportamento físico da polpa da fruta frente a esta técnica. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência das variáveis de processo na desidratação osmótica da polpa do abacate. A desidratação osmótica foi realizada com auxílio de um planejamento experimental fatorial com as seguintes variáveis: concentrações das soluções de sacarose (30 e 60% p/p), espessura do corte (0,5 e 1 cm) e temperatura de imersão (25 e 45 °C) tendo por variáveis de resposta a perda de água (PA), ganho de sólidos (GS) e relação ganho de sólidos/perda de água (GS/PA) em 200 minutos de processo. Os resultados obtidos mostraram que o nível máximo de perda de água (PA), de 55,53%, ocorreu na menor concentração de açúcar (30%), maior temperatura (45 °C) e menor espessura (0,5cm). O nível mínimo de PA (14,5%) foi observado tanto na combinação de maior concentração de açúcar (60%), espessura (1 cm) e temperatura (45 °C) como nas condições de menor temperatura (25 °C), menor concentração de sacarose (30%) e maior espessura (1cm). A espessura foi o parâmetro que mais influenciou o processo em relação às respostas (GS, PA e GS/PA) estudadas. A temperatura também obteve significância para a resposta GS/PA, e a concentração de sacarose não apresentou influência significativa, nas condições em que a pesquisa foi realizada.

Avocado is one kind of tropical fruit grown in different regions in the world, and it has high nutritional value, but it is unstable to damage. Osmotic dehydration is a useful technique for the conservation of fruit and vegetables, and it can be an alternative for the stabilization of avocado pulp. However, it is necessary to study the physical behavior of the fruit pulp in the face of this technique. Thus, the aim of this study was to evaluate the influence of process variables on avocado pulp osmotic dehydration. Osmotic dehydration was carried out with help of a factorial-experimental planning with the following variables: concentrations of sucrose solutions (30 and 60% w/w), section thickness (0.5 and 1cm) and immersion temperature (25 and 45 °C), in which the response variables are water loss (WL), gain of solids (GS) and gain of solids/water loss relation (GS/WL) in 200 minutes of process. The results showed that the highest level of water loss (WL), 55.53%, occurred at the lowest sucrose concentration (30%), highest temperature (45 °C) and smallest thickness (0.5cm). The minimum level of WL (14.5%) was observed both in the combination of higher sugar concentration (60%), thickness (1cm) and temperature (45 °C) and lower temperature (25 °C), lower concentration of sucrose (30%) and greater thickness (1cm). The thickness was the parameter that most influenced the process concerning the responses analyzed (GS, WL, and GS/WL). The temperature was also significant for the GS/WL response, and the sucrose concentration had no significant influence in the conditions in which the survey was conducted.

Osmotic and morphological effects on red blood cell membrane: action of an aqueous extract of Lantana camara / Efeitos osmótico e morfológico na membrana de hemácias: ação de um extrato aquoso de Lantana camara

The Lantana camara ("cambara de espinho") leaves infusions are used popularly in some countries to treat gastrointestinal diseases. Osmotic fragility assay and morphometric analysis have been used to verify the interaction of drugs with the membrane of red blood cells (RBC). The aim of this work was to evaluate the effects of an aqueous extract of Lantana camara on the osmotic fragility and on the morphology of RBC. Blood samples were treated with extract of Lantana camara (10 mg/mL), osmotic fragility assay and morphological analysis were carried out. In the presence of the extract, the data obtained indicated (i) a significant (p < 0.05) increase of hemolysis and (ii) modifications on the morphology of RBC. These effects of the Lantana camara may be associated with some pharmacological properties of the chemical compounds of this studied extract.

As infusões de folhas de Lantana camara (cambara-de-espinho) são usadas popularmente em alguns países para tratar doenças gastrointestinais. O experimento de fragilidade osmótica e a análise morfométrica têm sido usados para verificar a interação de drogas com a membrana de hemácias. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos de um extrato aquoso de Lantana camara na fragilidade osmótica e na morfologia de hemácias. Amostras de sangue foram tratadas com extrato de Lantana camara (10 mg/mL), o ensaio de fragilidade osmótica e a análise morfológica foram realizadas. Na presença do extrato, os dados obtidos indicaram (i) um aumento significativo (p < 0,05) da hemólise e (ii) modificações na morfologia das hemácias. Estes efeitos da Lantana camara poderiam estar associados com algumas propriedades farmacológicas de compostos químicos do extrato estudado.

Assessment of effects of a formula used in the traditional Chinese medicine (Buzhong Yi Qi Wan) on the morphologic and osmotic fragility of red blood cells

Buzhong Yi Qi Wan (BYQW) is a combination of some medicinal herbs widely used in traditional Chinese medicine to treat blood, spleen and stomach disorders. Morphometric analysis and osmotic fragility assay have been used to evaluate changes on membrane integrity of red blood cells. The aim of this work was to evaluate the effect of an aqueous BYQW extract on the morphology and osmotic fragility of red blood cells. Blood samples were treated with BYQW extract, quantitative/qualitative morphological analysis and osmotic fragility assay were carried out against control groups treated with saline. The data obtained indicated no modification on morphology but osmotic fragility assay suggested a significant (p<0.05) increasing of hemolysis in red blood cells isolated from blood treated with aqueous BYQW extract. In conclusion, the aqueous BYQW extract could affect the membrane integrity decreasing the osmotic resistance but without altering the shape of red blood cells.

Buzhong Yi Qi Wan (BYQW) é uma combinação de algumas ervas medicinais amplamente usada na medicina tradicional chinesa para tratar o sangue, baço e desordens do estômago. A análise morfométrica e o ensaio de fragilidade osmótica têm sido usados para avaliar alterações na integridade da membrana de hemácias. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos de um extrato aquoso de BYQW na morfologia e na fragilidade osmótica de hemácias. Amostras sangüíneas foram tratadas com o extrato de BYQW, análise morfológica quantitativa/qualitativa e o ensaio de fragilidade osmótica foram realizados e comparados com grupo controle tratado com salina. Os dados obtidos indicaram ausência de modificações na morfologia, mas o ensaio de fragilidade osmótica sugeriu um aumento significativo (p<0,05) da hemólise em hemácias isoladas de sangue tratado com extrato aquoso de BYQW. Em conclusão, o extrato aquoso de BYQW poderia afetar a integridade da membrana diminuindo a resistência osmótica sem alterar a forma das hemácias.